Researchers at the Centre for Genomic Regulation (CRG) in Barcelona and the Spanish National Cancer Research Centre (CNIO) in Madrid have captured the world’s first high-resolution images of the earliest moments of microtubule formation inside human cells. The findings, published today in the journal Science, lay the foundations for potential breakthroughs in treating many different types of diseases ranging from cancer to neurodevelopmental disorders.

“Microtubules are critical components of cells, but all the images we see in textbooks describing the first moments of their creation are models or cartoons based on structures in yeast. Here we capture the process in action inside human cells. Now that we know what it looks like, we can explore how it’s regulated. Given the fundamental role of microtubules in cell biology, this could eventually lead to new therapeutic approaches for a wide range of disorders,” explains ICREA Research Professor Thomas Surrey, main co-author of the study and researcher at the Centre for Genomic Regulation.

Molecular ‘highways’ of the cell

A cell is much like a bustling city, requiring state-of-the-art infrastructure to function. One of the most important components are microtubules, tubes made of proteins which act like bridges or roads that help move things around and give the cell its shape. Importantly, they are critical for cell division, ensuring that two new cells can be born from a parent cell. In neurons, they are absolutely essential, forming highways for transport over long distances.

Microtubules are built by a large assembly of proteins known as the gamma-tubulin ring complex (γ-TuRC). The proteins work like a blueprint, laying down tiny building blocks called tubulins in a specific order. This is a process called microtubule nucleation, which is like laying the foundation stones of a bridge. Once the foundation is set, tubulins are added to make the bridge as long as necessary.

For the cell to work correctly, microtubules need to be made of thirteen different rows of tubulins. A few years ago, researchers were baffled to discover that human γ-TuRC exposes fourteen rows of tubulins. This was confusing because researchers expected it to be a perfect template for microtubules, which did not seem to be the case. But high-resolution structures had only been pictured of either γ-TuRC or microtubules in isolation and never together – until now.

“We had to find conditions that allowed us to image over a million microtubules in the process of nucleation before they grow too long and obscure the action of γ-TuRC. We were able to achieve this using the molecular toolbox of our lab and then freeze the microtubule stubs in place", explains Cláudia Brito, postdoctoral researcher at the CRG and first author of the study.

High-resolution imaging

To observe γ-TuRC while it was actively forming microtubules, researchers prepared samples at the CRG in Barcelona and the Electronic Microscopy Center at ALBA (EMCA), where they were flash-frozen in a thin layer of ice – preserving the natural shape of the molecules involved and helping discern fine details of structures at near atomic level. Frozen samples were then sent to the Basque Resource for Electron Microscopy (BREM) in Vizcaya, where the high-resolution data generated was then transferred to be analysed at the CNIO in Madrid. Marina Serna, Staff Scientist at CNIO used the images obtained by cryo-electron microscopy and complex image processing methods to determine the 3D structure of γ-TuRC while forming microtubules.

This analysis revealed that as γ-TuRC starts the nucleation process and as the microtubule begins to form, it cleverly changes its shape. Initially in an open state, it progressively closes as the microtubule grows. The change makes γ-TuRC stow away one of its 14 tubulins, effectively matching the design of the microtubule that needs only 13 rows. The whole process is facilitated by a newly-discovered latch mechanism, revealing that it’s the growing microtubule itself which helps the template find its correct shape.

Oscar Llorca, Director of the Structural Biology program at CNIO and main co-author of the paper, explains: "We have visualized the process that initiates microtubule formation, and we see that human γ-TuRC is an open ring that closes to effectively become a perfect template to nucleate microtubules. But we also discovered that this ring, in order to close, needs the 'first brick' of a microtubule to be put in place; when this happens, a region of the human γ-TuRC acts as an anchor that engages this 'first brick' to then close the ring and launch the formation of the microtubules". 

Implications for human health and disease

The most well-known consequence of microtubule malfunction is cancer, a disease characterised by uncontrolled cell proliferation. Neurodevelopmental disorders such as microcephaly also occur when microtubule processes go wrong, as well as other conditions ranging from respiratory problems to heart disease.

Some cancer drugs work by targeting microtubules, preventing them from disassembling or forming in the first place. However, these disrupt microtubules indiscriminately in both cancerous and healthy cells, leading to side effects. Tumours also develop resistance to these drugs.

The findings of the study are important because understanding the precise mechanism of how microtubules are laid down could lead to the development of more targeted and effective cancer treatments, as well as new therapies for a broader range of conditions.

“The process of nucleation decides where the microtubules are in a cell and how many you have in the first place. It is likely that the conformational changes we observe are controlled by yet-to-be-found regulators in cells. Several candidates have been described in other studies, but their mechanism of action is unclear. As further work clarifies how regulators bind to γ-TuRC and how they affect the conformational changes during nucleation, it may transform our understanding of how microtubules work, and eventually offer alternative sites that one might want to target to prevent cancer cells from going through the cell cycle,” concludes Dr. Surrey. 

EN CASTELLANO

Capturan la primera película de cómo se construyen 'autopistas moleculares' en las células humana

Un equipo del Centro de Regulación Genómica (CRG) de Barcelona y el Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO) de Madrid han captado las primeras imágenes en alta resolución de los primeros momentos de formación de microtúbulos en el interior de las células humanas. Los hallazgos, publicados en la revista Science, sientan las bases para posibles avances en el tratamiento de muchos tipos diferentes de enfermedades que van desde el cáncer hasta los trastornos del neurodesarrollo.

"Los microtúbulos son componentes críticos de las células, pero todas las imágenes de los libros de texto que describen el proceso de formación son modelos o dibujos animados basados en estructuras de levaduras. Aquí capturamos el proceso en acción dentro de las células humanas. Ahora que sabemos cómo es, podemos explorar cómo se regula. Dado el papel fundamental de los microtúbulos en la biología celular, esto podría conducir a nuevos enfoques terapéuticos para una amplia gama de trastornos", explica el profesor de investigación ICREA Thomas Surrey, coautor principal del estudio e investigador del Centro de Regulación Genómica.

'Autopistas moleculares’ de la célula

Una célula es muy parecida a una ciudad. Requiere una infraestructura sofisticada para funcionar. Uno de los componentes más importantes son los microtúbulos, tubos formados por proteínas que actúan como puentes o carreteras que ayudan a mover las cosas y dan forma a la célula. Es importante destacar que son fundamentales para la división celular, ya que garantizan que puedan nacer dos nuevas células a partir de una. En las neuronas, son absolutamente esenciales, formando autopistas para el transporte a larga distancia.

Los microtúbulos están formados por un gran conjunto de proteínas conocido como el complejo de anillos gamma-tubulina (γ-TuRC). Las proteínas funcionan como una plantilla, colocando pequeños bloques de construcción llamados tubulinas en un orden específico. Este es un proceso conocido como la nucleación de microtúbulos, que es como colocar las piedras fundamentales de un puente. Una vez colocados los cimientos, se añaden tubulinas para alargar el puente todo lo que sea necesario.

Para que la célula funcione correctamente, los microtúbulos deben estar formados por trece filas de tubulina. Recientemente, el campo de la biología molecular se quedó perplejo al descubrir que el γ-TuRC humano expone catorce filas de tubulinas. Esto fue confuso porque se esperaba que el γ-TuRC fuera una plantilla perfecta para los microtúbulos, y no parecía ser el caso. Pero las estructuras de alta resolución solo habían capturado γ-TuRC o microtúbulos de forma aislada y nunca juntos, hasta ahora.

"Tuvimos que encontrar condiciones que nos permitieran obtener imágenes de más de un millón de microtúbulos en el proceso de nucleación antes de que crecieran demasiado y oscurecieran la acción de γ-TuRC. Pudimos lograrlo utilizando la caja de herramientas moleculares de nuestro laboratorio y luego congelar los talones de microtúbulos en su lugar", explica Cláudia Brito, investigadora postdoctoral en el CRG y coprimera autora del estudio.

Imágenes de alta resolución

Para observar el γ-TuRC mientras formaba microtúbulos, el equipo preparó muestras en el CRG y en el Centro Conjunto de Microscopía Electrónica del ALBA (JEMCA), donde se congelaron rápidamente en una fina capa de hielo, preservando la forma natural de las moléculas implicadas y ayudando a discernir los detalles finos de las estructuras a nivel atómico. 

A continuación, las muestras congeladas se enviaron al BREM en Vizcaya, donde los datos de alta resolución generados se transfirieron para ser analizados en el CNIO de Madrid. Marina Serna, científica del CNIO, utilizó las imágenes obtenidas por criomicroscopía electrónica y otros métodos complejos para determinar la estructura 3D del γ-TuRC durante la formación de microtúbulos.

El análisis reveló que a medida que γ-TuRC inicia el proceso de nucleación y se comienzan a formar los microtubulos, la plantilla cambia su forma. Inicialmente en estado abierto, se cierra progresivamente a medida que el microtúbulo crece. El cambio hace que γ-TuRC guarde una de sus 14 tubulinas, coincidiendo efectivamente con el diseño del microtúbulo que solo necesita 13 filas. Todo el proceso se ve facilitado por un mecanismo de cierre, que muestra que es el propio microtúbulo en crecimiento el que ayuda a la plantilla a encontrar su forma correcta.

Óscar Llorca, director del programa de Biología Estructural del CNIO y coautor principal del artículo, explica: "Hemos visualizado el proceso que inicia la formación de microtúbulos, y vemos que el γ-TuRC humano es un anillo abierto que se cierra para convertirse efectivamente en una plantilla perfecta para formar núcleos en los microtúbulos. Pero también descubrimos que este anillo, para cerrarse, necesita que se coloque el 'primer ladrillo' de un microtúbulo; cuando esto sucede, una región del γ-TuRC humano actúa como un ancla que engancha este 'primer ladrillo' para luego cerrar el anillo y poner en marcha la formación de los microtúbulos".

Consecuencias para la salud y las enfermedades humanas

La consecuencia más conocida del mal funcionamiento de los microtúbulos es el cáncer, una enfermedad caracterizada por una proliferación celular descontrolada. Los trastornos del neurodesarrollo, como la microcefalia, también ocurren cuando los procesos de los microtúbulos fallan, así como otras afecciones que van desde problemas respiratorios hasta enfermedades cardíacas.

Algunos fármacos contra el cáncer actúan dirigiéndose a los microtúbulos, evitando que se desmonten o se formen en primer lugar. Sin embargo, estos alteran los microtúbulos indiscriminadamente tanto en las células cancerosas como en las sanas, lo que provoca efectos secundarios. Los tumores también desarrollan resistencia a estos fármacos.

Los hallazgos del estudio son importantes porque comprender el mecanismo preciso de cómo se establecen los microtúbulos podría conducir al desarrollo de tratamientos contra el cáncer más específicos y efectivos, así como nuevas terapias para muchas enfermedades distintas.

"El proceso de nucleación decide dónde están los microtúbulos en una célula y cuántos tienes en primera instancia. Es probable que los cambios conformacionales que observamos estén controlados por reguladores aún no encontrados en las células. En otros estudios se han descrito varios candidatos, pero su mecanismo de acción no está claro. A medida que el trabajo adicional aclara cómo los reguladores se unen al γ-TuRC y cómo afectan los cambios conformacionales durante la nucleación, puede transformar nuestra comprensión de cómo funcionan los microtúbulos y, finalmente, ofrecer sitios alternativos a los que uno podría querer apuntar para evitar que las células cancerosas pasen por el ciclo celular", concluye el Dr. Surrey. 

EN CATALÀ

Capturen la primera pel·lícula de com es construeixen 'autopistes moleculars' a les cèl·lules humanes 

Un equip del Centre de Regulació Genòmica (CRG) de Barcelona i el Centre Nacional d'Investigacions Oncològiques (CNIO) de Madrid han captat les primeres imatges en alta resolució dels primers moments de formació de microtúbuls a l'interior de les cèl·lules humanes. Les troballes, publicades a la revista Science, senten les bases per a possibles avenços en el tractament de molts tipus diferents de malalties que van des del càncer fins als trastorns del neurodesenvolupament.

"Els microtúbuls són components crítics de les cèl·lules, però totes les imatges dels llibres de text que descriuen el procés de formació són models o dibuixos animats basats en estructures de llevats. Aquí capturem el procés en acció dins de les cèl·lules humanes. Ara que sabem com és, podem explorar com es regula. Atès el paper fonamental dels microtúbuls en la biologia cel·lular, això podria conduir a nous enfocaments terapèutics per a una àmplia gamma de trastorns", explica el professor de recerca ICREA Thomas Surrey, coautor principal de l'estudi i investigador del Centre de Regulació Genòmica.

'Autopistes moleculars' de la cèl·lula

Una cèl·lula és molt semblant a una ciutat. Requereix una infraestructura sofisticada per funcionar. Un dels components més importants són els microtúbuls, tubs formats per proteïnes que actuen com ponts o carreteres que ajuden a moure les coses i donen forma a la cèl·lula. És important destacar que són fonamentals per a la divisió cel·lular, ja que garanteixen que puguin néixer dues noves cèl·lules a partir d'una. A les neurones, són absolutament essencials, formant autopistes per al transport a llarga distància.

Els microtúbuls estan formats per un gran conjunt de proteïnes conegut com el complex d'anells gamma-tubulina (γ-TuRC). Les proteïnes funcionen com una plantilla, col·locant petits blocs de construcció anomenats tubulines en un ordre específic. Aquest és un procés conegut com a nucleació de microtúbuls, que és com col·locar les pedres fonamentals d'un pont. Un cop col·locats els fonaments, s'afegeixen tubulines per allargar el pont tot el que sigui necessari.

Perquè la cèl·lula funcioni correctament, els microtúbuls han d'estar formats per tretze files de tubulina. Recentment, el camp de la biologia molecular es va quedar perplex en descobrir que el γ-TuRC humà exposa catorze files de tubulines. Això va ser confús perquè s'esperava que el γ-TuRC fos una plantilla perfecta per als microtúbuls, i no semblava ser el cas. Però les estructures d'alta resolució només havien capturat γ-TuRC o microtúbuls de forma aïllada i mai junts, fins ara.

"Vàrem haver de trobar condicions que ens permetessin obtenir imatges de més d'un milió de microtúbuls en el procés de nucleació abans que creixessin massa i enfosquissin l'acció de γ-TuRC. Vam poder aconseguir-ho utilitzant la caixa d'eines moleculars del nostre laboratori i després congelar els talons de microtúbuls al seu lloc", explica Clàudia Brito, investigadora postdoctoral al CRG i coprimera autora de l'estudi.

Imatges d'alta resolució

Per observar el γ-TuRC mentre formava microtúbuls, l'equip va preparar mostres al CRG i al Centre Conjunt de Microscòpia Electrònica de l'ALBA (JEMCA), on es van congelar ràpidament en una fina capa de gel, preservant la forma natural de les molècules implicades i ajudant a discernir els detalls fins de les estructures a nivell atòmic. 

A continuació, les mostres congelades es van enviar al BREM a Biscaia, on les dades d'alta resolució generades es van transferir per ser analitzades al CNIO de Madrid. Marina Serna, científica del CNIO, va utilitzar les imatges obtingudes per criomicroscòpia electrònica i altres mètodes complexos per determinar l'estructura 3D del γ-TuRC durant la formació de microtúbuls.

L'anàlisi va revelar que a mesura que γ-TuRC inicia el procés de nucleació i es comencen a formar els microtúbuls, la plantilla canvia la seva forma. Inicialment en estat obert, es tanca progressivament a mesura que el microtúbul creix. El canvi fa que γ-TuRC guardi una de les seves 14 tubulines, coincidint efectivament amb el disseny del microtúbul que només necessita 13 files. Tot el procés es veu facilitat per un mecanisme de tancament, que mostra que és el mateix microtúbul en creixement el que ajuda la plantilla a trobar la seva forma correcta.

Òscar Llorca, director del programa de Biologia Estructural del CNIO i coautor principal de l'article, explica: "Hem visualitzat el procés que inicia la formació de microtúbuls, i veiem que el γ-TuRC humà és un anell obert que es tanca per convertir-se efectivament en una plantilla perfecta per formar nuclis als microtúbuls. Però també descobrim que aquest anell, per tancar-se, necessita que es col·loqui el 'primer maó' d'un microtúbul; quan això succeeix, una regió del γ-TuRC humà actua com una àncora que enganxa aquest 'primer maó' per després tancar l'anell i posar en marxa la formació dels microtúbuls".

Conseqüències per a la salut i les malalties humanes

La conseqüència més coneguda del mal funcionament dels microtúbuls és el càncer, una malaltia caracteritzada per una proliferació cel·lular descontrolada. Els trastorns del neurodesenvolupament, com la microcefàlia, també ocorren quan els processos dels microtúbuls fallen, així com altres afeccions que van des de problemes respiratoris fins a malalties cardíaques.

Alguns fàrmacs contra el càncer actuen dirigint-se als microtúbuls, evitant que es desmuntin o es formin en primer lloc. No obstant això, aquests alteren els microtúbuls indiscriminadament tant en les cèl·lules canceroses com en les sanes, la qual cosa provoca efectes secundaris. Els tumors també desenvolupen resistència a aquests fàrmacs.

Les troballes de l'estudi són importants perquè comprendre el mecanisme precís de com s'estableixen els microtúbuls podria conduir al desenvolupament de tractaments contra el càncer més específics i efectius, així com noves teràpies per a moltes malalties diferents.

"El procés de nucleació decideix on són els microtúbuls en una cèl·lula i quants en tens en primera instància. És probable que els canvis conformacionals que observem estiguin controlats per reguladors encara no trobats a les cèl·lules. En altres estudis s'han descrit diversos candidats, però el seu mecanisme d'acció no està clar. A mesura que el treball addicional aclareix com els reguladors s'uneixen al γ-TuRC i com afecten els canvis conformacionals durant la nucleació, pot transformar la nostra comprensió de com funcionen els microtúbuls i, finalment, oferir llocs alternatius als quals un podria voler apuntar per evitar que les cèl·lules canceroses passin pel cicle cel·lular", conclou el Dr. Surrey. 

Funding acknowledgements / Financiación / Finançament

Some of the work was carried out at the Joint Electron Microscopy Center at ALBA (JEMCA), a new centre within the ALBA Synchrotron building offering electron microscope services to the scientific community. Eight different partners will be sharing this centre; the Institute for Molecular Biology of Barcelona (IBMB-CSIC), the Catalan Institute for Nanoscience and Nanotechnology (ICN2), the Institute for Biomedical Research (IRB Barcelona), the Centre for Genomic Regulation (CRG), the Institute for Materials Science of Barcelona (ICMAB-CSIC), the Spanish National Research Council (CSIC), the Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), and the ALBA Synchrotron. The project definition phase also included the fundamental support of the Barcelona Institute of Science and Technology (BIST). Fifty percent of the cost of the microscopes was financed by the European Regional Development Fund (ERDF), with the support of the Ministry for Research and Universities of the Government of Catalonia, through the aid for the implementation of cooperative projects for the creation, construction, acquisition and improvement of shared scientific and technological equipment and platforms, under the framework of the ERDF Operational Programme for Catalonia 2014-2020. 

El Centro Conjunto de Microscopía Electrónica en ALBA (JEMCA por su nombre en inglés, Joint Electron Microscopy Center at ALBA) es fruto de la colaboración entre diferentes entidades de investigación para poner en marcha una nueva instalación dentro del Sincrotrón ALBA que ofrece servicios de microscopía electrónica a la comunidad científica. Concretamente, ocho socios distintos participan en este centro: el Instituto de Biología Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC), el Instituto Catalán de Nanociencia y Nanotecnología (ICN2), el Instituto de Investigación Biomédica (IRB Barcelona), el Centro de Regulación Genómica (CRG), el Instituto de Ciencia de Materiales de Barcelona (ICMAB-CSIC), el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), la Universitat Autònoma de Barcelona (UAB) y el Sincrotrón ALBA. En la fase de definición del proyecto se contó con el apoyo fundamental del Barcelona Institute of Science and Technology (BIST). El 50% del coste de los microscopios ha sido financiado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), con el apoyo del Departament de Recerca i Universitats de la Generalitat de Catalunya, mediante la ayuda para la realización de proyectos cooperativos de creación, construcción, adquisición y mejora de equipamientos y plataformas científicas y tecnológicas compartidas, en el marco del programa Operativo FEDER de Cataluña 2014-2020. 

El Centre Conjunt de Microscòpia Electrònica a l’ALBA (JEMCA pel seu nom en anglès, Joint Electron Microscopy Center at ALBA) és fruit de la col·laboració entre diferents entitats de recerca per posar en marxa una nova instal·lació dins del Sincrotró ALBA que ofereix serveis de microscòpia electrònica a la comunitat científica. Concretament, vuit socis diferents participen en aquest centre: l’Institut de Biologia Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC), l’Institut Català de Nanociència i Nanotecnologia (ICN2), l’Institut de Recerca Biomèdica (IRB Barcelona), el Centre de Regulació Genòmica (CRG), l’Institut de Ciència de Materials de Barcelona (ICMAB-CSIC), el Consell Superior d’Investigacions Científiques (CSIC), la Universitat Autònoma de Barcelona (UAB) i el Sincrotró ALBA. En la fase de definició del projecte es va comptar amb el suport fonamental del Barcelona Institute of Science and Technology (BIST). El 50% del cost dels microscopis ha estat finançat pel Fons Europeu de Desenvolupament Regional (FEDER), amb el suport del departament de Recerca i Universitats de la Generalitat de Catalunya, mitjançant l’ajut per a la realització de projectes cooperatius de creació, construcció, adquisició i millora d'equipaments i plataformes científiques i tecnològiques compartides, dins el marc del programa Operatiu FEDER de Catalunya 2014-2020.